اختبار البول بواسطة الكروماتوجرافي ذات الطبقة الرقيقة بواسطة شريط الاختبار TLC



اختبار البول بواسطة الكروماتوجرافي ذات الطبقة الرقيقة بواسطة شريط الاختبار (TLC):

الهدف:

  • تحديد الأحماض الأمينية الموجودة في البول.
  • التعرف على بعض الأمراض الناتجة من خلل في أيض الأحماض الأمينية.

المقدمة والمبدأ: 

  • في العديد من أمراض الأيض يكون تركيز بعض الأحماض الأمينية مرتفع في البلازما أو البول أو كلاهما.
  • وغالباُ ما يكون ناتج من نقص بعض الأنزيمات نتيجة لسبب وراثي ذو علاقة بأيض حمض أميني معين ومثال ذلك (Phenylketonuria).
  • وهذه الأمراض ممكن الكشف عنها بواسطة الكروماتوجرافي ذات الطبقة الرقيقة.

عوامل فصل المواد في الكروتوجرافي:

وفصل المواد في الكروتوجرافي يعتمد على عدة عوامل:

1- تجزؤ المادة المذابة (المادة المراد الكشف عنها):

تتجزأ المادة المراد الكشف عنها بين وسط يتحرك ووسط ثابت المادة المذابة تتحرك باتجاه حركة المذيب (الوسط المتحرك).
بسرعة تحدد بذوبانية المادة المذابة في الوسط المتحرك. 

2- تأثير التبادل الأيوني (ion exchange effect):

أي شوائب أيونية في الوسط الدعامي (الوسط الثابت) تؤدي إلى الارتباط بين الشحنات المختلفة، من المادة المراد فصلها والوسط الدعامي، وبهذا ستؤدي إلى الإقلال من سرعتها.  

3- درجة الحرارة (temperature):

من المعروف أن ذوبانية بعض المواد تزداد بازدياد الحرارة، أي أن الحرارة عامل مهم يتحكم في ذوبانية بعض المواد.  

4- الوزن الجزيئي (molecular weight):

الوزن الجزيئي للمادة يؤثر على ذوبانيتها وعلى سرعة حركتها.

5- ادمصاص المواد المراد فصلها للوسط الدعامي (adsorption):

نظرياُ يجب أن يكون الوسط الدعامي خامل (أي ليست لديه القدرة على التفاعل) ولكن ليست هذه الحالة دائماُ.
فإذا كان الوسط الدعامي خاملاُ والمادة المارد فصلها لديها القدرة على الارتباط به فإن هذا سيؤدي إلى الاقلال من ذوبانيته وبالتالي حركته في الوسط المذيب ستعاق.

6- مكونات المذيب: 
بما أن بعض المواد تكون ذائبيتها في بعض المذيبات أكثر من الأخرى فإن خليط المذيب المستخدم له تأثير على عملية الفصل.
يستخدم المصطلح (Rf) السريان النسبي (relative flow) للتعبير عن تصرف المادة المراد فصلها في الوسط المستخدم (المذيب/ الوسط الدعامي).

المواد والأدوات:

  • المذيب (يبوتانول: حمض الخليك: ماء) بنسبة 25:15:60.
  • محلول (1-) عبارة عن فينيل الانين (5مل مول/لتر).
  • محلول (-) عبارة عن سيستيين (5مل مول/لتر).
  • عينة بول.
  • كاشف ننهيدرين.
  • حجرة كروماتوجرافي (   ).
  • الكروماتوجرافي ذات الطبقة الرقيقة.
  • فرن ذو درجة حرارة 110.

الطريقة: 

  • في هذه التجربه ستختبري بول طبيعي وبول من شخص مريض بأحد أمراض الأيض.
  • انقلي بواسطة الماصه أقل من البول في مخبار مدرج سعته 1 مل وأكملِ الحجم الباقي بالماء.
  • انقلِ البول المخفف إلى أنبوبة اختبار حتى تتأكدي من أنه مزج جيداُ.
  • الآن يوجد لديك عينة مخففة (10:1) من شخص مريض بمرض فينل كيتون يوريا (phenylketonuria) وسيستين يوريا (cystinuria) ويوجد لديك عينة البول الطبيعي.

طريقة استخدام الكروماتوجرافي:

  • بواسطة القلم الرصاص ارسمي خطاُ يكون بعده من القاعدة 2 سم. ارسمِ الخط بحذر حتى لا يخدش السطح.
  • قسمِ الخط الذي حصلت عليه تقسيماُ متساوياُ.
  • ضعِ عينة البوال المخفف بواسطة الماصة الشعرية، كل عينة في موضع مستقل.
  • قطر العينة بجب أن لا يتجاوز2 مم.
  • ضعِ المذيب في حجرة الكروماتوجرافي.
  • ضعِ الكروماتوجرافي بها أيضاُ.
  • تغطى حجرة الكروماتوجرافي جيداُ.
  • سيتحرك المذيب بواسطة الخاصية الشعرية من خلال الكروماتوجرافي.
  • حينما يرتفع المذيب أو الوسط المتحرك إلى الجزء العلوي من الكروماتوجرافي (1-2 سم قبل أن يصل إلى الحافة العلوية).
  • يرفع الكروماتوجرافي وتوضع علامة عند المسافة التي وصل إليها المذيب.
  • ثم يترك ليجف.
  • رشي الكروماتوجرافي بمحلول الننهيدرين.
  • تترك لتجف.
  • توضع في فرن لمدة خمس دقائق في درجة حرارة 110°م.
  • سيظهر موقع الأحماض الأمينية كبقعة ملونة.